产品内容：
提取液：液体80mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体21mL×2瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×2支，-20℃保存；
试剂三：粉剂×2支，4℃保存；
工作液的配制：临用前取试剂一、试剂二、试剂三各一支，将试剂二和试剂三依次转移到试剂一中混合溶解。
 
产品说明：
线粒体复合体Ⅳ又称细胞色素C氧化酶，也是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分，负责催化还原型细胞色素C的氧化，并最终把电子传递给氧生成水。还原型细胞色素C在550nm有特征光吸收，线粒体复合体Ⅳ催化还原型细胞色素C 生成氧化型细胞色素C，因此550nm光吸收下降速率能够反映线粒体复合体Ⅳ酶活性。
试验中所需的仪器和试剂：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
 
操作步骤：
一、复合体Ⅳ的提取：   
① 称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1.0 mL提取液，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
② 4 ℃ 600 g离心10min。
③ 将上清液移至另一离心管中，4 ℃ 11000 g离心15min。
④ 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅳ（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。
⑤ 在沉淀中加入400uL提取液，超声波破碎（功率20％，超声5秒，间隔10秒，重复15次），用于复合体Ⅳ酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。
二、测定步骤：
1、 可见分光光度计预热30min 以上，调节波长至550nm，蒸馏水调零。
2、 样本测定
（1） 将工作液置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育15min；用不完的试剂4℃可保存一周；
（2） 在1mL玻璃比色皿中分别加入
试剂名称
测定管
空白
样品（μL）
40
-
蒸馏水（μL）
-
40
工作液（μL）
800
800
立即混匀，分别记录测定管和空白管550nm处初始吸光值A1和1min后的吸光值A2，测定管的记为A1测定管，A2测定管，空白管的记为A1空白管，A2空白管。计算ΔA1=A1测定管-A2测定管，ΔA2=A1空白管-A2空白管，ΔA=ΔA1-ΔA2。
三、复合体Ⅳ活力单位的计算：
单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化降解1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅳ活力(U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=1099×ΔA÷Cpr
V 反总：反应体系总体积，8.4×10-4 L；ε：细胞色素C摩尔消光系数，1.91×104 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.04 mL； T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，需自行测定，建议使用本公司BCA蛋白浓度测定试剂盒

相关文献：
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